基因工程的新工具 生命最古老的分支

伊利諾伊大學比爾梅特卡夫微生物學教授g .威廉阿倫茲和博士后研究員迪皮蒂納亞克的一項新研究首次記錄了CRISPR-Cas9介導的基因組編輯在生命的第三個領域——古細菌中的應用。他們發(fā)表在《美國國家科學院院刊》上的開創(chuàng)性工作可能會大大加速這些生物的未來研究，并對包括全球氣候變化在內(nèi)的研究產(chǎn)生影響。梅特卡夫和納亞克是伊利諾伊州卡爾沃爾斯基因組生物學研究所的成員。

“在大多數(shù)情況下，與大腸桿菌相比，我們的模式古細菌醋酸甲烷八疊球菌的倍增時間為8至10小時，大腸桿菌可以在大約30分鐘內(nèi)倍增。這意味著遺傳和獲得突變體可能需要幾個月的時間——同樣的事情在大腸桿菌中需要三天，”納亞克解釋說?！霸诜浅；镜膶用嫔希珻RISPR-Cas9讓我們能夠做到的是加快整個流程。它消除了一個主要瓶頸.用這個古細菌做基因研究的時候。

“更有甚者，”納亞克繼續(xù)說道，“通過我們以前的技術，突變必須一步一步引入。利用這項新技術，我們可以同時引入多個突變。我們可以利用CRISPR擴大突變體生成的過程。”

CRISPR是簇狀規(guī)則間隔短回文重復的縮寫，它開始作為古細菌和細菌的免疫防御系統(tǒng)。Cas(CRISPR相關系統(tǒng))蛋白通過識別和儲存外源DNA的短片段，可以在未來快速識別DNA，從而快速破壞，保護機體免受病毒入侵。

自從被發(fā)現(xiàn)以來，免疫系統(tǒng)的一個版本——CRISPR-Cas9——已經(jīng)被修改以在實驗室編輯基因組。通過將Cas9與特定的工程RNA導向的而不是侵入性的DNA片段配對，可以引導CRISPR系統(tǒng)在任何位置切割細胞基因組，從而去除現(xiàn)有基因或添加新基因。該系統(tǒng)在編輯來自酵母、植物、魚類甚至人類細胞的真核系統(tǒng)方面有著豐富的經(jīng)驗，獲得了美國科學促進會2015年度突破獎。然而，其在原核物種中的實施遇到了障礙，部分原因是其不同的細胞過程。

為了在細胞系統(tǒng)中使用CRISPR，研究人員必須開發(fā)一種方案，該方案考慮到細胞首選的DNA修復機制：在CRISPR的“分子剪刀”切割染色體后，細胞修復系統(tǒng)通過一種機制介入修復損傷。其他遺傳物質(zhì)可以通過。在真核細胞中，這采取非同源末端連接的形式(NHEJ)。雖然這種方法已經(jīng)被用于CRISPR介導的編輯，但它有一種傾向，即在其修復過程中引入遺傳錯誤：核苷酸，DNA階梯的步驟，通常在切割位點添加或刪除。

NHEJ在原核生物中非常罕見，包括古細菌；相反，它們的DNA通常通過一種叫做同源定向修復的過程進行修復。通過比較DNA模板的損傷，同源定向修復創(chuàng)造了Nayak所說的“確定性模板”——最終結果可以提前預測，并根據(jù)研究人員的確切需求進行調(diào)整。

在許多方面，同源定向修復實際上更適合基因組編輯：“雖然我們希望CRISPR-Cas9在真核系統(tǒng)中被定向編輯，但因為NHEJ，我們經(jīng)常得到我們不想要的東西，”Nayak解釋說?！霸谶@方面，大部分古細菌菌株不具備非同源末端連接的修復系統(tǒng)是一件好事，所以DNA能夠修復的唯一途徑就是通過這種確定性的同源修復途徑?！?

雖然看似違反直覺，納亞克和梅特卡夫首先使用CRISPR-Cas9將NHEJ機制引入甲烷八疊球菌。納亞克說，盡管基因組編輯通常不受歡迎，但NHEJ有一個優(yōu)于同源修復的用途：“如果你只想刪除一個基因，如果你不在乎如何刪除.非同源末端連接實際上更有效。”

通過使用引入的NHEJ修復系統(tǒng)的所謂“敲除”研究，其中單個基因被移除或沉默，以觀察基因可能影響的變化和過程，納亞克說，未來的研究將能夠組裝醋桿菌和其他古老物種的遺傳圖譜。這樣的圖譜對于涉及古細菌的各種研究領域非常有用，包括梅特卡夫實驗室特別感興趣的領域，即氣候變化。

“甲烷八疊球菌是最具遺傳性的古老菌株之一，”納亞克說。“[產(chǎn)甲烷細菌]是一種古生物，每年都會產(chǎn)生這種強大的溫室氣體。它在全球碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，因此對全球氣候變化做出了重大貢獻。”通過研究這種生物和類似生物的遺傳學，納亞克和梅特卡夫不僅希望對古菌遺傳學有更深入的了解，還希望獲得它們在更廣泛的環(huán)境過程中的作用。

總之，這項研究代表了一個令人興奮的研究和操縱古細菌的新方向?！拔覀冮_始這項研究是為了確定CRISPR-Cas9基因組編輯是否可以用于古菌，”Nayak總結道。“我們發(fā)現(xiàn)，與真核系統(tǒng)相比，這不僅是可能的，而且非常有效。”

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