誘變育種的基本步驟有哪些（誘變育種的基本步驟）

關(guān)于誘變育種的基本步驟有哪些，誘變育種的基本步驟這個(gè)問(wèn)題很多朋友還不知道，今天小六來(lái)為大家解答以上的問(wèn)題，現(xiàn)在讓我們一起來(lái)看看吧！

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：以紫外線誘變獲得用于醬油生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌株為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本操作方法。

2、內(nèi)容：1．對(duì)米曲霉(Aspergillsoryzae)出發(fā)菌株進(jìn)行處理，制備孢子懸液。

3、2．用紫外線進(jìn)行誘變處理。

4、3．用平板透明圈法進(jìn)行兩次初篩。

5、4．用搖瓶法進(jìn)行復(fù)篩及酶活性測(cè)定。

6、二、實(shí)驗(yàn)材料和用具米曲霉斜面菌種；豆餅斜面培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、蒸餾水、0.5%酪蛋白；三角瓶(300mL、500mL)、試管、培養(yǎng)皿(9cm)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無(wú)菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精燈。

7、三、操作步驟(一)出發(fā)菌株的選擇及菌懸液制備1．出發(fā)菌株的選擇可直接選用生產(chǎn)醬油的米曲霉菌株，或選用高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株。

8、2.菌懸液制備取出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接至豆餅斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～5d活化。

9、然后孢子洗至裝有1***.lmol/LpH6.0的無(wú)菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內(nèi)裝玻璃珠，裝量以大致鋪滿瓶底為宜)，30℃振蕩30min，用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過(guò)濾，制成把子懸液，調(diào)其濃度為106～108個(gè)/mL，冷凍保藏備用。

10、(二)誘變處理用物理方法或化學(xué)方法，所用誘變劑種類(lèi)及劑量的選擇可視具體情況決定，有時(shí)還可采用復(fù)合處理，可獲得更好的結(jié)果。

11、本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用紫外線照射的誘變方法。

12、1．紫外線處理打開(kāi)紫外燈(30W)預(yù)熱20min。

13、取5mL菌懸液放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿(9cm)中，同時(shí)制作5份。

14、逐一操作，將培養(yǎng)皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上，照射lmin后打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，開(kāi)始照射，與照射處理開(kāi)始的同時(shí)打開(kāi)磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，即時(shí)計(jì)算時(shí)間，照射時(shí)間分別為15s、30s、lmin、2min、5min。

15、照射后，誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h然后在紅燈下稀釋涂菌進(jìn)行初篩。

16、2．稀釋菌懸液按10倍稀釋至10-6，從10-5和10-6中各取出0.lmL加入到酪素培養(yǎng)基平板中(每個(gè)稀釋度均做3個(gè)重復(fù))，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置，于30℃恒溫培養(yǎng)2～3d。

17、(三)優(yōu)良菌株的篩選1.初篩首先觀察在菌落周?chē)霈F(xiàn)的透明圈大小，并測(cè)量其菌落直徑與透明圈直徑之比，選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50個(gè)，作為復(fù)篩菌株。

18、2．平板復(fù)篩分別倒酪素培養(yǎng)基平板，在每個(gè)平皿的背面用紅筆劃線分區(qū)，從圓心劃線至周邊分成8等份，1～7份中點(diǎn)種初篩菌株，第8份點(diǎn)種原始菌株，作為對(duì)照。

19、培養(yǎng)48h后即可見(jiàn)生長(zhǎng)，若出現(xiàn)明顯的透明圈，即可按初篩方法檢測(cè)，獲得數(shù)株二次優(yōu)良菌株，進(jìn)大搖瓶復(fù)篩階段。

20、3．搖瓶復(fù)篩將初篩出的菌株，接入米曲霉復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其方法是，稱(chēng)取麥秩85g，豆餅粉(或面粉)15g，加水95～110mL(稱(chēng)為潤(rùn)水)，水含量以手捏后指縫有水而不下滴為宜，于500mL三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm)，121℃濕熱滅菌30min，然后分別接入以上初篩獲得的優(yōu)良菌株，30℃培養(yǎng)，24h后搖瓶一次并均勻鋪開(kāi)，再培養(yǎng)24～48h，共培養(yǎng)3～5d后檢測(cè)蛋白酶活性。

21、4．蛋白酶的測(cè)定方法(1)取樣：培養(yǎng)后隨機(jī)稱(chēng)取以上搖瓶培養(yǎng)物1g，加蒸餾水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液測(cè)定酶活性。

22、另取lg培養(yǎng)物于105℃烘干測(cè)定含水量。

23、(2)酶活性測(cè)定：30℃pH7.5條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白)，每分鐘產(chǎn)酪氨酸1μg為一個(gè)酶活力單位。

24、計(jì)算公式為：(A樣品OD680nm值-A對(duì)照OD680nm值)×K×V/t×NK：標(biāo)準(zhǔn)曲線中光吸收為“1”時(shí)的酪氨酸微克數(shù)；V：酶促反應(yīng)的總體積；t：酶促反應(yīng)時(shí)間(min)；N：酶的稀釋倍數(shù)。

25、5．谷氨酸的檢測(cè)此項(xiàng)檢測(cè)也是醬油優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)之一。

26、檢測(cè)培養(yǎng)基：豆餅粉：麩夫=6：4，潤(rùn)水75%，121℃濕熱滅菌30min。

27、谷氨酸測(cè)定：于以上培養(yǎng)基中加入7%鹽水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d后過(guò)濾，以濾液檢測(cè)谷氨酸含量(測(cè)壓法)。

28、四、注意事項(xiàng)1.紫外線照射時(shí)注意保護(hù)眼睛和皮膚。

29、2.誘變過(guò)程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進(jìn)行，并在黑暗中培養(yǎng)。

30、五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.試列表說(shuō)明高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選過(guò)程和結(jié)果。

31、2.你認(rèn)為以上的篩選方法有什么優(yōu)缺點(diǎn)，如何改進(jìn)？六、問(wèn)題和思考1．試述紫外線誘變的作用機(jī)理及其在具體操作中應(yīng)注意的問(wèn)題。

32、2．為什么在誘變前要把菌懸液打散和培養(yǎng)一段時(shí)間？注：篩選菌株數(shù)的計(jì)算若按突變率為0.01計(jì)算，則一次篩選可取250—300個(gè)菌落，第一次篩選后可多選幾株高產(chǎn)株，而二級(jí)篩選為重點(diǎn)階段，其最適量可參考以下計(jì)算方法：如初篩菌株數(shù)為200株，二次篩選欲選株數(shù)為2株，則二級(jí)應(yīng)選(200×2)1/2，為20株，這樣的數(shù)量選擇，使有可能從較少的數(shù)量中獲得相對(duì)較多的優(yōu)良菌株。

本文分享完畢，希望對(duì)大家有所幫助。

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